外泌體是包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡，是細胞間信號傳輸的載體。多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，參與細胞間通訊。近年來，外泌體的研究熱度持續(xù)攀升，在2019年國家自然科學基金獲批項目中，外泌體研究相關項目的總數突破500個，立項的總金額突破2億元。但由于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規(guī)的光學顯微鏡無法對其進行成像分析，因此很少有技術能夠對單個外泌體進行物理表征和蛋白分型。

美國NanoView Biosciences公司推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，采用了特色的SP-IRIS成像技術，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計數、粒徑、蛋白表達、蛋白共定位、亞群分布的分析。全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌體領域科研工作者的廣泛關注，目前在全球已近100多個實驗室采用該技術，發(fā)表文獻超過200篇。進入2022年，使用ExoView發(fā)表的論文出現井噴性增長，短短數月已經發(fā)表了超過94篇。本文選取了2022年的7篇在高水平期刊《Journal of Extracellular   Vesicles》發(fā)表的比較有代表性的文章，來說明ExoView在單外泌體亞群分析、血漿、光誘導、神經酰胺、3D細胞培養(yǎng)、心功能不全、疫苗等研究領域的具體應用。

1. 對從T淋巴母細胞和前列腺癌細胞釋放的外泌體CD47、整合素和四跨膜蛋白進行單外泌體水平綜合分析

CD47可調節(jié)特定編碼和非編碼 RNA 向外泌體的運輸，并且CD47+外泌體的RNA含量與從相同細胞釋放的CD63+外泌體的RNA含量不同。Sukhbir Kaur^[1]等使用ExoView對野生型、 CD47 缺陷型 Jurkat T 淋巴母細胞系和PC3前列腺癌細胞系衍生的外泌體的四跨膜蛋白、整合素和CD47進行共定位分析。結果表明在Jurkat細胞衍生的外泌體上，β1和α4整合素亞基主要與CD47和CD81實現共定位，沒有與CD63和CD9實現共定位，驗證了早先研究的結果。此外，PC3細胞衍生的外泌體很難檢測到α4整合素，但它的CD81與β1、CD47存在特異性關聯�？傊�，CD47+外泌體與CD63+、CD9+外泌體不同，它可通過待確認的機制間接調節(jié)攜帶非相互作用四跨膜蛋白的外泌體豐度。

圖1 ExoView對從 野生型、CD47缺陷型Jurkat T 淋巴母細胞以及野生型、CD47 缺失型的PC3 前列腺癌細胞釋放的外泌體進行無熒光標記和熒光標記分析

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[1] Sukhbir   Kaur ……& David D. Roberts. (2022) Single vesicle analysis of CD47 association with integrins and tetraspanins on extracellular vesicles released by T lymphoblast and prostate carcinoma cells. Journal of  Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12265.

2. 四跨膜蛋白區(qū)分人血清和血漿中不同的外泌體亞群-血漿樣品中血小板外泌體的貢獻

早期研究證明從血液中分離外泌體的能力對于將外泌體開發(fā)為疾病的生物標志物至關重要，尤其是從血漿和血清中分離外泌體，但很少有研究系統(tǒng)地比較這些外泌體來源的類型。Nasibeh Karimi^[2]等對確定血漿和血清中不同外泌體亞群的存在進行了研究。研究人員采集健康受試者血液，分別用K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血漿，同時用血清凝塊激活劑管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和質譜等技術分析分離出的外泌體亞群。結果表明人類血液中含有多個攜帶不同四跨膜蛋白的外泌體亞群，使用不同的抗凝劑和離心方法，會影響外泌體亞群的分析。

圖2 ExoView檢測從血漿、血清、人肥大細胞系分離的外泌體的數量、共定位和粒徑

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[2] Nasibeh Karimi ……& Cecilia L?sser. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma – Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213.

3. 光誘導免疫功能外泌體的高效產生

基于外泌體的治療方法和疫苗的不斷興起，臨床應用劑量規(guī)模的研發(fā)始終是一個巨大的瓶頸。為了克服這樣的障礙，Shaobo Ruan^[3]等開發(fā)了一種簡單直接的方法，通過利用近紫外LED燈（365 nm）的光感應來促進樹突狀細胞分泌外泌體 (DEV)。體外和體內實驗的結果顯示，近紫外波長不會損害細胞生長，使DEV生產率提高了13倍以上，同時讓DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成為理想的治療平臺。

圖3 ExoView檢測mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性標記物的數量、共定位以及進行熒光成像

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[3] Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles,   https://doi.org/10.1002/jev2.12194.

4. 神經酰胺轉運蛋白在外泌體起源和鞘脂組成中的作用

早先研究顯示神經酰胺可以誘導外泌體的形成，但神經酰胺的調控機制還有待確認。Simone M. Crivelli^[4]等發(fā)現神經酰胺轉運蛋白 (CERT) 在內質網 (ER) 和接觸位點的多泡核內體之間介導神經酰胺的非囊泡轉運，而該過程取決于CERT的PH結構域與核內體中PI4KIIα生成的PI4P的相互作用。此外，Tsg101蛋白是運輸所需的內體分選復合物 (ESCRT-I) 的一部分，在攜帶神經酰胺的 CERT 的 START 結構域和Tsg101蛋白之間形成復合物，。結果表明，抑制神經酰胺的合成減少了CERT-Tsg101復合物的形成。CERT的過度表達會增加外泌體的分泌，而抑制CERT會減少外泌體的形成以及降低外泌體中神經酰胺和鞘磷脂的濃度。

圖4  ExoView對 HPA-12治療組和對照組的外泌體進行計數以及通過對神經酰胺標記進行熒光成像

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[4] Simone M. Crivelli ……& Erhard Bieberich. (2022) Function of ceramide transfer protein for biogenesis and sphingolipid composition of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, 11:e12233.

5. 用于分離3D細胞培養(yǎng)衍生外泌體的快速管道

外泌體的近期細胞生物學研究顯示對3D細胞培養(yǎng)衍生外泌體的需求不斷增加，因為它被認為可以更精確地代表體內外泌體。因此，開發(fā)將外泌體從3D細胞培養(yǎng)物中分離出來的有效且可調控的方法變得非常迫切。Heikki   Kyykallio^[5]等使用納米原纖維纖維素 (NFC) 支架作為3D細胞培養(yǎng)基質，開發(fā)了兩種不同方法的管道，可用于從癌癥球體中分離外泌體。其中，一種分批處理方法可以在培養(yǎng)期結束時提高外泌體產量，而另一種收獲方法可實現外泌體的時間依賴性收集，將外泌體分析與球體開發(fā)相結合。這兩種方法都易于快速設置，并且提高外泌體產量。結果表明，與在超低吸附培養(yǎng)板上無支架培養(yǎng)相比，NFC方法可進行定制化且更易于操作，從而實現外泌體的高產量。

圖5 ExoView檢測使用NFC的3D細胞培養(yǎng)衍生的外泌體，統(tǒng)計各捕獲位點的外泌體數量以及進行熒光成像

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[5] Heikki Kyykallio ……& Pia R-M Siljander. (2022) A quick pipeline for the isolation of 3D cell culture-derived extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12273.

6. 含miR-421的外泌體與空氣污染（PM2.5）誘導心功能不全的發(fā)生機制相關

大氣細顆粒物（PM2.5，空氣動力學直徑≤2.5 μm）是空氣污染的主要原因。越來越多的證據表明，大氣PM2.5濃度的升高與總死亡率呈正相關，尤其是心血管疾病和呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率。   PM2.5急性/亞急性暴露對人體的危害不容忽視，但是對于呼吸系統(tǒng)亞急性暴露于PM2.5所誘發(fā)心臟功能不全的分子機制尚不全清楚。上海大學王紅云^[6]等在大氣污染相關的心血管疾病研究方面取得新進展，揭示了大氣PM2.5亞急性暴露引發(fā)心功能不全的新的分子機制：大氣PM2.5亞急性暴露在肺損傷后促進外泌體釋放其攜帶的miR-421，通過抑制ACE2導致   PM2.5誘導的心功能不全。

圖6  ExoView檢測從暴露于PM2.5的細胞上清液提取的外泌體和對照組外泌體的計數、粒徑以及進行熒光成像

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[6] Hongyun Wang ……& Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppresses air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signalling. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12222.

7. 基于細菌外泌體的新型疫苗對疾病的保護作用

自從新冠疫情爆發(fā)以來，有多種不同技術路線的疫苗在抗疫中發(fā)揮了重大作用。然而現有的疫苗有諸如穩(wěn)定性、保存、反應速率、產量等問題，而且病毒變種如Delta的流行，進一步降低了疫苗的保護效率，需要疫苗技術的突破來克服。Jiang和Driedonks^[7]等通過在細菌的外泌體表面修飾病毒S蛋白的受體結合結構域（RBD）制成了新型疫苗。革蘭氏陰性菌能夠產生外膜囊泡（OMV），在哺乳動物體內具有免疫刺激作用，誘導炎癥發(fā)生并激活樹突細胞、T細胞和B細胞等免疫細胞，而經過改造的工程菌能夠產生降低了內毒性的OMV。

圖7 ExoView對RBD-OMV組以及對照組的外泌體的表型進行無熒光標記和熒光標記分析

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[7] A bacterial extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type and Delta variants.

在上述7篇文章中，科學家借助美國NanoView Biosciences公司研發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，直接檢測樣本中的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結果直接輸出外泌體粒徑，絕對數目，蛋白表型，不同亞群的含量、多色熒光成像圖。7篇文章分別從單外泌體亞群分析、血漿、光誘導、神經酰胺、3D細胞培養(yǎng)、心功能不全、疫苗等研究領域介紹了ExoView的無需純化，全面表征的特點，有力地證明ExoView是外泌體檢測的一大利器。

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? 上海大學在《Journal of extracellular vesicles》發(fā)表文章。

?  中國科學院深圳技術研究院在《Lab on a Chip》發(fā)表文章。

?  北京天壇醫(yī)院、國家納米科學中心、北京航空航天大學在《Advanced Science》發(fā)表文章。

?  同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院、上海思路迪轉化醫(yī)學在《Journal of Nanobiotechnology》發(fā)表文章。

? 山東千佛山醫(yī)院在《NANO LETTERS》發(fā)表文章

? 南京大學在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》發(fā)表文章

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